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MTT檢測細胞活性的操作方法
來源:云南樹森生物科技有限公司 發布時間:2018年09月21日
一、MTT是什么
MTT是一種粉末狀化學試劑,全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,漢語化學名為 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
二、MTT法用來做什么
簡單地說:是一種檢測細胞存活和生長的方法。
MTT主要有兩個用途
1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;
2.細胞增殖及細胞活性測定。
三、為何MTT可以用來做上述工作
檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值,在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值),來判斷活細胞數量,OD值越大,細胞活性越強(如果是測藥物毒性,則表示藥物毒性越?。?。
四、實驗所需材料
1.MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。
市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g
1.1對于100mg這樣的小包裝,廠家都是將MTT放入小管中的,個人建議不要再用天平稱量分裝,而應該一次性將其全配制成溶液,如100mg用20mlPBS來溶解。具體做法:預先在50ml離心管(沒有的話,可用培養瓶替代)加入20ml PBS,從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中,吹打若干次后將其移入50ml離心管,然后再混勻??梢灾貜蛶状?,以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT完全混勻后,用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌,分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細胞培養板每孔需加10ul計算,一般每96孔板約需1ml,所以分裝時可考慮每管分裝1ml。
1.2對于大包裝,可按上述方法稱取一部分溶解,也有人將粉劑分裝在EP管里,用的時候現配,直接往培養板中加。
注意事項:
1. 在配制和保存的過程中,容器最好用鋁箔紙包住。
配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感
MTT一般最好現用現配,過濾后4度避光保存兩周內(個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液,效果仍然不錯)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,避免反復凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用。
MTT有致癌性,用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.
2.MTT甲瓚溶解液
2.1二甲基亞砜DMSO,可以直接溶解,無需配制,使用方便,溶解速度快,但對人體毒性較大,且需去除原培養液,在去除培養液的過程中,可能會把結晶去掉,導致結果不穩定。
2.2三聯溶解液:SDS10g,異丁醇5ml,10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液,該溶解液不需去除原培養基,但溶解較慢。
該溶解液因含有SDS,在低溫保存的時候易產生結晶,因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,將SDS結晶全部溶解后再使用。
五、MTT法實驗步驟
1.胰酶消化對數期細胞,終止后離心收集,制成細胞懸液,細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。
對于初學者而言,要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手,我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數量。
以一般細胞培養常用的625px2為例,
1)細胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為80%~90%密度時細胞的大致狀態),消化離心收集后,將上清去掉,加入3ml培養基使其混勻。
2)另取一支新的15ml無菌離心管(為下一步接種96孔板用),裝入約9ml培養基.
3)從第一步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管,混勻后細胞計數,此時一般為或小于5-10×104/ml,該濃度相當于細胞計數板4個大格內每大格平均5-10個細胞(見下圖);如果不夠該濃度,再根據計數的結果滴加細胞懸液,每滴按50ul計算。
4)細胞數量因實驗目的不同應做相應調整,如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以(相當于細胞懸液密度為2×104/ml),細胞毒性實驗每孔5000—10000個(相當于細胞懸液密度為5×104/ml)。此外,還應根據細胞本身特性,如生長快慢,來決定細胞數量。比如:生長較快的細胞密度可略小。
2.將細胞懸液制備好后,輕輕混勻,每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。
注意:因細胞在混勻后仍要繼續沉降,因此接種的過程中要反復多次混勻,如每加6個孔就混勻一次,以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同,這對于MTT的結果至關重要。
3.將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設6個,否則難以反應真實情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。
對于加藥,有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中,以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好,然后將96孔板中的培養上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養基,這樣能保證藥物濃度的準確。另外,需注意的是,如果用這種方法,不要把96孔板的培養液全部吸走后再加藥,應該吸完一部分后立即加樣,避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。
4.5%CO2,37℃孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用。
5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。
6. 終止培養,準備溶解結晶。
溶解結晶的方法有兩種,第一種,用DMSO溶解
1) MTT加入培養4h后,結晶可充分形成。將上清去掉,該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走,也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面,然后將96孔板輕輕倒置,這樣上清便被濾紙吸走,以減少結果的損失。個人認為,這兩種方法都有可能導致結晶的損失,從而引起結果的不準確。采用哪種方法,可以自己摸索一下再決定。
2) 每孔加入150ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
另一種方法,用三聯溶解液(見上面MTT甲瓚溶解液)
1) MTT加入培養4h后,結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉,直接在每孔加入100ul溶解液。(該溶解液因含有SDS,在低溫保存的時候易產生結晶,因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,將SDS結晶全部溶解后再使用。)
2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時,鏡下觀察,待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右,紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少,溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多,溶解的時間會長一些。
在實際的操作過程中,往往為了等待4—6小時,使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值,給實驗者帶來了很大的不方便。個人曾經摸索,加入溶解液后過夜再測對OD值基本無影響,但要注意的是一定要避光,不過培養箱關閉后本身就是閉光的,所以加入溶解液后放入培養箱中,第二天上班時再測OD值就可以了。
7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。
六、MTT結果分析
關于如何計算IC50
1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:最大陽性反應率
Pn:最小陽性反應率

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